植物 (Plant) 果糖 1,6 二磷酸醛缩酶 (FBA)操作说明

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验 (ELISA) 。往 预先包被植物果糖1,6二磷酸醛缩酶 (FBA) 抗体的包被微孔中，依 次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。 用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的 作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物果糖1,6二磷 酸醛缩酶 (FBA) 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度  (OD 值) ，计算样品活性。

样品收集、处理及保存方法

1.  样本不能含叠氮钠 (NaN3) ，因为叠氮钠 (NaN3) 是辣根过氧 化物酶 (HRP) 的抑制剂。

2.  标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。

3.  植物萃取液或其它相关样本：请1000 x g离心20分钟，取上清 即可检测。

4.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存

于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪 (450nm)

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1.  试剂盒保存在 2-8℃ ，使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的 浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解 后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封 (低温干燥) 保 存。

3.  浓度为 0 的 S0 号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明 书操作时样本已经稀释 5 倍，最终结果乘以 5 才是样本实际浓度。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

注：标准品 (S0-S5) 浓度依次为：0，20，40，80，160，320 U/mL

试剂的准备

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1：20 稀释，即 1 份的20×洗涤 缓冲液加 19 份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽 孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板 5 次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液 350 μL，浸泡 1min，洗板 5 次。

1.  从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自 封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μ L；

3.  样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液 40 μL；空白孔不 加。

4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶  (HRP) 标记的检测抗体 100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅 或恒温箱温育 60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去 洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次 (也可用洗板机洗板) 。

6.  每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育 15min。

7.  每孔加入终止液 50 μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

结果判断

绘制标准曲线：在 Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应 OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样 本浓度值。

免责声明

1.   试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所 产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2.   严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者 承担。

试剂盒性能

1.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数 R 值，大于等于

0.9900。

2.  灵敏度：最低检测浓度小于 0.1 U/mL。

3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.  重复性：板内、板间变异系数均小于 15%。

5.  贮藏：2-8℃ ，避光防潮保存。

6.  有效期：6 个月